ESPRESSIONE NON TARGET DI VIRUS CRE E ADENOVIRUS NEI TOPI WILD-TYPE C57BL / 6J

La trasfezione in situ delle cellule T da parte di nanoparticelle lipidiche coniugate con anticorpi anti-CD3 porta all’attivazione, migrazione e alterazione fenotipica delle cellule T

• La programmazione ex vivo dei linfociti T può essere efficace, ma è complessa e costosa; pertanto, è importante sviluppare metodi per la trasfezione in situ dei linfociti T. Abbiamo sviluppato e ottimizzato nanoparticelle lipidiche anti-CD3 (aCD3-LNP) per fornire mRNA del gene reporter strettamente imballato specificamente alle cellule T. LNP mirato in vitro ha consegnato con successo  mRNA mCherry   alle cellule T Jurkat e l’attivazione e l’eliminazione delle cellule T sono state associate al   rivestimento anticorpale  aCD3 sulla superficie dell’LNP. aCD3-LNP, ma non LNP non mirato, accumulato nella milza dopo l’iniezione sistemica, con   segnali mCherry   e Fluc visibili entro 30 minuti dall’iniezione.A 24 ore dopo l’iniezione di aCD3-LNP, il 2-4% di tutte le cellule T della milza e il 2-7% di tutte le cellule T circolanti esprimevano   mCherry  e questo dipendeva dalla densità del guscio di aCD3.
• Il targeting e la trasfezione sono stati accompagnati dall’attivazione sistemica dei linfociti T  CD25 ⁺  , OX40  ⁺  e CD69  ⁺   con perdita transitoria del ligando CD3e e deplezione della milza e dei sottogruppi circolanti. CD8a  ^{+ migrazione della milza} Cellule T da polpa bianca a polpa rossa e differenziazione dai fenotipi ingenui ai fenotipi della memoria e degli effettori hanno seguito la consegna di aCD3-LNP. Inoltre, l’iniezione di aCD3-LNP ha stimolato la secrezione di chemochine derivate da mieloidi e citochine T-helper nel plasma. Infine, abbiamo somministrato aCD3-LNP a topi portatori di tumore e abbiamo scoperto che le cellule T trasfettate si sono localizzate nei tumori e nei linfonodi drenanti il ​​tumore dopo il trattamento con immunoterapia. Presi insieme, dimostriamo che la trasfezione diretta da CD3 è possibile ma ha complesse conseguenze immunologiche che devono essere ulteriormente studiate per potenziali applicazioni terapeutiche.

Effetto della modifica molecolare sull’efficacia dell’invasione di vettori baculovirali ricombinanti su cellule di mammifero e sua immunogenicità nei topi

1. Tuttavia, la bassa espressione di GP64 nei baculovirus ricombinanti riduce anche l’efficienza della trasduzione del baculovirus ricombinante nelle cellule di mammifero. Inoltre, il promotore del baculovirus  non ha attività di espressione nelle cellule di mammifero e quindi non può soddisfare i requisiti applicativi dei vettori del baculovirus per BDS  .
2. Sulla base di ricerche precedenti, questo studio ha prima determinato l’attività di espressione dei promotori nelle   cellule di insetto Spodoptera frugiperda   9 e nelle cellule di mammifero e ha testato con successo il primissimo   promotore pie1   per mediare la coespressione di molti geni.
3. In secondo luogo, sfruttando l’effetto di presentazione dell’involucro proteico INVASIN e VSVG, l’efficienza della trasduzione delle particelle di baculovirus ricombinante in cellule non ospiti è stata notevolmente migliorata.
4. Infine, sulla base del miglioramento di cui sopra, è stato costruito con alta efficienza un vettore di baculovirus ricombinante che mostra le quattro proteine ​​antigeniche. Rispetto al BDS tradizionale, il sistema rBacmid-Δgp64 ha mostrato un  aumento di circa 3 volte dell’efficienza di visualizzazione della proteina bersaglio e ha indotto un aumento di circa 4 volte del   titolo anticorpale sierico  contro antigeni bersaglio nei topi Bal B / c.
5. Questo studio ha esplorato sistematicamente l’uso di una nuova tecnologia di co-visualizzazione multi-gene nella ricerca multi-vaccino ei risultati forniscono la base per lo sviluppo di nuove tecnologie BDS.

Disturbo della funzione cinetocore da parte della proteina legante GFP nel lievito di scissione

• L’uso di mutazioni genetiche per studiare la funzione delle proteine ​​in vivo è un paradigma centrale della biologia moderna. Gli anticorpi camelidi a dominio   singolo generati  contro GFP sono stati progettati come nanocorpi o proteine ​​​​leganti GFP (GBP) che possono legare GFP nonché alcune varianti GFP con elevata affinità e selettività. In questo studio, abbiamo utilizzato la  proteina di fusione GBP-mCherry  come strumento per interrompere le funzioni naturali di diverse proteine ​​​​cinetocore nel lievito diviso Schizosaccharomyces pombe.
• Abbiamo scoperto che le cellule che esprimono sia    la proteina Cnp1 del cinetocore interno marcata con GBP- mCherry che GFP erano sensibili al calore e al tiabendazolo (TBZ) del farmaco dei microtubuli. Inoltre, GBP-mCherry che prende di mira il cinetocore  da parte di   diverse importanti proteine ​​​​del cinetocore etichettate con GFP causa difetti nella fedele segregazione dei cromosomi. Pertanto, questa impostazione viola le funzioni dei cinetocori e fa sì che le cellule si comportino come mutanti condizionali.
• Il nostro studio evidenzia il potenziale dell’utilizzo di GBP come strumento generale per interrompere la funzione di alcune proteine ​​​​etichettate con GFP in vivo per comprendere la loro importanza funzionale per determinati processi fisiologici, non solo nel lievito ma anche potenzialmente in altri sistemi modello.

ESPRESSIONE NON TARGET DI VIRUS CRE E ADENOVIRUS NEI TOPI WILD-TYPE C57BL / 6J

• I virus adeno-associati (AAV) sono uno strumento ampiamente utilizzato nelle neuroscienze per etichettare, tracciare e/o manipolare in modo efficiente le popolazioni neuronali. Il targeting altamente specifico può essere ottenuto dalla ricombinasi dipendente dall’AAV in combinazione con linee di roditori transgenici che esprimono la ricombinasi Cre in alcuni tipi di cellule. La visualizzazione dell’espressione del virus viene in genere ottenuta con proteine ​​reporter fluorescenti (ad es. GFP o   mCherry  ) confezionate nel genoma AAV. Sebbene la fluorescenza non amplificata sia generalmente sufficiente per osservare l’espressione del virus, l’amplificazione immunoistochimica di un reporter fluorescente viene utilizzata di routine per migliorare visualizzazione dei virus. Nel presente studio, l’AAV Cre-dipendente è stato iniettato nella corteccia di nuovi topi C57BL / 6J di tipo selvatico.
• Sebbene abbiamo osservato un’espressione del doppio frame di lettura aperto invertito (DIO) debole ma coerente non amplificata oltre il target target nei topi C57BL / 6J,   l’amplificazione dell’anticorpo reporter GFP o  mCherry   ha rivelato una notevole espressione indipendente da Cre del virus. L’espressione a valle dei costrutti DIO nei topi C57BL / 6J wild-type era indipendente dal venditore, dal sierotipo AAV o dal promotore. Abbiamo anche valutato se l’espressione indipendente da Cre ha un effetto funzionale attraverso i recettori del recettore del progettista attivato solo dal progettista (DREADD).

Dato l’uso diffuso di DIO AAV ricombinanti da parte della comunità delle neuroscienze, i nostri dati supportano un’attenta considerazione quando si utilizzano costrutti DIO negli animali di controllo.