Analisi citometrica a flusso di sottopopolazioni apoptotiche con una combinazione di annessina V-FITC, ioduro di propidio e SYTO 17

1. Questo studio è stato condotto per valutare la traslocazione della fosfatidilserina nella membrana plasmatica della testa del gradiente di Percoll purificato dallo sperma dell’epididimo cauda del coniglio durante la capacitazione e la reazione acrosomiale (AR) utilizzando l’Annessina-V. Lo ioduro di propidio è stato utilizzato come controllo per respingere le cellule morte o morenti.
2. La presenza e la distribuzione dei siti di legame dell’annessina-V sono state analizzate mediante fluorocitometria a flusso e microscopia confocale. Dopo 6 h di incubazione dello sperma nel mezzo di capacitazione, il numero di cellule colorate positivamente con l’annessina-V ha mostrato un piccolo ma significativo incremento.
3. I siti di legame dell’annessina-V prodotti durante la capacitazione sono stati trovati principalmente nella regione post-acrosomale della membrana plasmatica della testa dello sperma.
4. Dopo l’induzione di AR con progesterone, la localizzazione della fosfatidilserina è stata modificata e i siti di legame dell’Annessina-V sono stati trovati quasi solo nella regione acrosomiale, ma con un numero maggiore di siti di legame nell’area equatoriale. Al contrario, dopo l’induzione di AR con A23187, la traslocazione della fosfatidilserina, sebbene predominante sulla regione acrosomiale, è stata osservata anche nella regione post-acrosomale.
5. La destabilizzazione della membrana plasmatica durante la capacitazione e l’AR possono essere importanti per la fusione spermatozoo-ovocita.

Analisi confocale dell’esternalizzazione della fosfatidilserina con l’uso dell’annessina V biotinilata  rivelata  con  streptavidina – FITC , -europio, -ficoeritrina o -Texas Red in cellule apoptotiche trattate con ossisterolo.

• Per analizzare l’esternalizzazione della fosfatidilserina tramite l’annessina V su cellule apoptotiche mediante microscopia confocale a scansione laser e analisi fattoriale di sequenze di immagini biomediche (FAMIS).
• Streptavidina-fluoresceina isotiocianato (FITC), -europio (Eu), -ficoeritrina (PE) e -Texas Red (TR) sono stati scelti per rivelare il legame dell’annessina V biotinilata su cellule leucemiche umane U937 apoptotiche e cellule endoteliali umane ECV-304 indotte in trattamento con 7-chetocolesterolo o 7 beta-idrossicolesterolo. L’eccitazione di ciascun fluorocromo è stata ottenuta mediante la selezione di linee specifiche (351 + 364 nm, 488 nm) del laser ad argon di un microscopio confocale. Sono state eseguite serie temporali e spettrali per caratterizzare ciascun fluorocromo. FAMIS è stato applicato a queste serie per stimare le immagini corrispondenti alle macchie.
• Ciascun fluorocromo è stato chiaramente distinto e le immagini hanno mostrato la localizzazione della fosfatidilserina, che è stata migliorata dall’analisi dell’immagine.

Sulle cellule apoptotiche è possibile analizzare le differenze nella migliore visualizzazione della fosfatidilserina in serie elaborate da FAMIS con l’uso dell’annessina V biotinilata rivelata con streptavidina-FITC, -Eu, -PE o -TR