Rilevamento del romanzo coronavirus 2019 (2019-nCoV) mediante RT-PCR in tempo reale

Succintamente

Lo scoppio in corso di recente è emerso il nuovo coronavirus (2019-nCoV) che rappresenta una sfida per i laboratori di sanità pubblica in quanto isolati di virus non sono disponibili mentre ci sono prove crescenti che l’epidemia è più diffusa di quanto si pensasse inizialmente, e lo fa la diffusione internazionale attraverso i viaggiatori già si verificano.

Obiettivo: abbiamo mirato a sviluppare e implementare solida metodologia diagnostica per l’uso nella sanità pubblica impostazioni di laboratorio senza materiale disponibile per i virus. Metodi: qui presentiamo una diagnostica validata flusso di lavoro per 2019-nCoV, il cui design si basa sulla chiusura relazione genetica del 2019-nCoV con il coronavirus SARS, avvalendosi della tecnologia dell’acido nucleico sintetico.

Risultati: il flusso di lavoro rileva in modo affidabile 2019-nCoV, e discrimina ulteriormente 2019-nCoV da SARS-CoV. Attraverso il coordinamento tra accademico e pubblico laboratori, abbiamo confermato l’esclusività del dosaggio in base su 297 campioni clinici originali contenenti un intero spettro di virus respiratori umani. Il materiale di controllo è reso disponibile attraverso European Virus Archive Global (EVAg), un progetto di infrastruttura dell’Unione Europea.

Conclusione: il presente studio dimostra il enorme capacità di risposta ottenuta attraverso il coordinamento di laboratori accademici e pubblici a livello nazionale e reti di ricerca europee

COVID-19, dove siamo?

Secondo l’Organizzazione mondiale della sanità (OMS), il L’OMS China Country Office è stato informato dei casi di polmonite di eziologia sconosciuta nella città di Wuhan, Hubei Provincia, il 31 dicembre 2019. Un nuovo coronavirus attualmente definito 2019-nCoV è stato annunciato ufficialmente come agente causale dalle autorità cinesi su 7 gennaio È stata rilasciata una sequenza del genoma virale per il supporto immediato della salute pubblica tramite la risorsa online della comunità virological.org il 10 gennaio (Wuhan-Hu-1, numero di accesso GenBank MN908947), seguito da altri quattro genomi depositati su 12 Gennaio nel database delle sequenze virali a cura di Iniziativa globale sulla condivisione di tutti i dati sull’influenza (GISAID).

Le sequenze del genoma suggeriscono la presenza di un virus strettamente correlato ai membri di una specie virale definita CoV correlato alla sindrome respiratoria acuta grave (SARS), una specie definita dall’agente dell’epidemia del 2002/03 di SARS nell’uomo. La specie comprende anche a gran numero di virus per lo più rilevati nel rinolofide
pipistrelli in Asia e in Europa.

Al 20 gennaio 2019, 282 confermati in laboratorio casi umani sono stati notificati all’OMS. Confermato i casi nei viaggiatori di Wuhan sono stati annunciati il ​​13 e il 17 gennaio in Tailandia e il 15 gennaio a Giappone e 19 gennaio in Corea. L’estensione della trasmissione umano-umana di 2019-nCoV non è chiara al momento della stesura di questo rapporto ma ci sono prove di qualche trasmissione da uomo a uomo.

Tra le priorità principali per facilitare la salute pubblica gli interventi è una diagnosi di laboratorio affidabile. In acuto infezione respiratoria, la RT-PCR viene abitualmente utilizzata per rilevare virus causativi da secrezioni respiratorie. abbiamo precedentemente dimostrato la fattibilità dell’introduzione solida tecnologia di rilevamento basata su RT-PCR in tempo reale nei laboratori di sanità pubblica durante le emergenze sanitarie internazionali mediante il coordinamento tra pubblico e laboratori accademici.

In tutte queste situazioni, gli isolati di virus erano disponibili come primari substrato per stabilire e controllare i test e prestazione del dosaggio. Nel caso presente di 2019-nCoV, virus isola o finora i campioni di pazienti infetti non sono diventati disponibile per la comunità internazionale di sanità pubblica. Riportiamo qui sull’istituzione e la convalida di un flusso di lavoro diagnostico per lo screening 2019-nCoV e conferma specifica, progettata in assenza di disponibile isolati di virus o campioni originali di pazienti. Design e la validazione sono state rese possibili dalla stretta parentela genetica con la SARS-CoV del 2003 e aiutate dall’uso di tecnologia di acido nucleico sintetico.

Campioni clinici e coltura cellulare di coronavirus surnatanti per la valutazione iniziale del dosaggio

I supernatanti di colture cellulari contenenti coronavirus tipizzati e altri virus respiratori sono stati forniti da Laboratori di ricerca Charité e Università di Hong Kong. Sono stati ottenuti campioni respiratori durante 2019 da pazienti ricoverati presso Charité medical centro e testato dal patogeno respiratorio NxTAG panel (Luminex, S´Hertogenbosch, Paesi Bassi) o in caso di MERS-CoV da parte di MERS-CoV upE test come pubblicato prima.

Campioni aggiuntivi sono stati selezionati dalle biobanche del Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM), Bilthoven, presso Erasmus University Medical Center, Rotterdam, presso Public Health England (PHE), Londra e presso il Università di Hong Kong. Campioni da tutte le raccolte composto di espettorato e tamponi di naso e gola con o senza mezzo di trasporto virale.

Campioni fecali contenenti SARS derivati ​​da pipistrelli Campioni CoV (identificati dall’adesione di GenBank numeri) sono stati testati: KC633203, Betacoronavirus BtCoV / Rhi_eur / BB98-98 / BGR / 2008; KC633204, Betacoronavirus BtCoV / Rhi_eur / BB98–92 / BGR / 2008; KC633201, Betacoronavirus BtCoV / Rhi_bla / BB98–22 / BGR / 2008; GU190221 Betacoronavirus Bat coronavirus BR98–19 / BGR / 2008; GU190222 Betacoronavirus Bat coronavirus BM98–01 / BGR / 2008; GU190223, Betacoronavirus Bat coronavirus BM98–13 / BGR / 2008. Tutto l’RNA sintetico utilizzato in questo studio è stato quantificato fotometricamente.

Estrazione di RNA

L’RNA è stato estratto da campioni clinici con Sistema MagNA Pure 96 (Roche, Penzberg, Germania) e dai supernatanti di colture cellulari con l’RNA virale mini kit (QIAGEN, Hilden, Germania).

PCR per trascrizione inversa in tempo reale

Una reazione di 25 μL conteneva 5 μL di RNA, 12,5 μL di 2 × tampone di reazione fornito con Apice III sistema RT-PCR in un solo passaggio con Platinum Taq Polymerase (Invitrogen, Darmstadt, Germania; contenente 0,4 mM di ogni desossiribato trifosfati (dNTP) e 3,2 mM magnesio solfato), 1 μL di trascrittasi inversa / Miscela Taq dal kit, 0,4 μL di una soluzione di magnesio solfato 50 mM (Invitrogen) e 1 μg di albumina sierica bovina non acetata (Roche). Primer e le sequenze della sonda, nonché le concentrazioni ottimizzate sono mostrate nella.

Tutti gli oligonucleotidi erano sintetizzato e fornito da Tib-Molbiol (Berlino, Germania). Il ciclo termico è stato eseguito a 55 ° C per 10 minuti per la trascrizione inversa, seguita da 95 ° C per 3 minuti e poi 45 cicli di 95 ° C per 15 s, 58 ° C per 30 S. I laboratori partecipanti hanno utilizzato Roche Light Strumenti Cycler 480II o Applied Biosystems ViiA7 (Applied Biosystems, Hong Kong, Cina).

Opzioni di protocollo e note applicative

I laboratori che hanno partecipato alla valutazione hanno utilizzato il
TaqMan Fast Virus Master Mix in 1 passaggio (Thermo Fisher) con le stesse concentrazioni di oligonucleotidi e condizioni di ciclismo. Il kit QIAGEN RT-PCR in un solo passaggio è stato anche testato e trovato compatibile.

La reattività crociata prevista di tutti i test con virale L’RNA di SARS-CoV ci consente di utilizzare i test senza dover fare affidamento su fonti esterne di specifici 2019- nCoV RNA.

Per un flusso di lavoro di routine, si consiglia il dosaggio del gene E. come strumento di screening di prima linea, seguito da test di conferma con il test del gene RdRp. Applicazione di il saggio del gene RdRp con tecnologia a doppio colore può discriminare 2019-nCoV (entrambe le sonde positive) da
SARS-CoV RNA se quest’ultimo viene utilizzato come controllo positivo.

In alternativa, i laboratori possono scegliere di eseguire RdRp test con solo la sonda specifica per 2019-nCoV.

Che cosa abbiamo ottenuto?

Prima del rilascio pubblico di sequenze di virus da casi di 2019-nCoV, abbiamo fatto affidamento sui rapporti sui social media che annunciano il rilevamento di un virus simile alla SARS. Abbiamo quindi assunto che un CoV correlato alla SARS è coinvolto nell’epidemia.

Abbiamo scaricato tutto completo e parziale (se> 400 nt) Sequenze di virus correlate alla SARS disponibili in GenBank da 1 gennaio 2020. L’elenco (n = 729 voci) è stato manualmente sequenze controllate e artificiali (di laboratorio, sintetico, ecc.), così come i duplicati di sequenza rimosso, risultante in un elenco finale di 375 sequenze.

Queste sequenze erano allineate e l’allineamento era utilizzato per la progettazione del dosaggio (Figura supplementare S1). Su rilascio della prima sequenza 2019-nCoV in virologica. org, tre saggi sono stati selezionati in base a quanto bene si sono abbinati al genoma 2019-nCoV. Il l’allineamento è stato completato da ulteriori sequenze rilasciato indipendentemente su GISAID , confermando il buon abbinamento tra quelli selezionati primer per tutte le sequenze.

Sensibilità del dosaggio basata sul coronavirus SARS virioni

Per ottenere una valutazione preliminare della sensibilità analitica, abbiamo usato il surnatante di coltura cellulare purificato contenente virioni del ceppo Frankfurt-1 del ceppo SARS-CoV su cellule Vero. Il surnatante era ultrafiltrato e così concentrato da un volume di ca 20 volte di cella surnatante di cultura. La fase di concentrazione riduce contemporaneamente la concentrazione relativa di acidi nucleici di fondo come virali non impaccati dal virione RNA.

La preparazione del virione è stata quantificata mediante RT-PCR in tempo reale utilizzando uno specifico RNA trascritto in vitro standard di quantificazione come descritto in Drosten et al. Tutti i test sono stati sottoposti a test replicati in per determinare le frequenze di rilevazione stocastica all’end point della sensibilità di ciascun dosaggio . Tutti i test sono stati altamente sensibili, con i migliori risultati ottenuto per i test del gene E e del gene RdRp (5.2 e 3,8 copie per reazione con una probabilità di rilevazione del 95%, rispettivamente).

Questi due saggi sono stati scelti per ulteriori valutazione. Uno dei laboratori partecipanti al la valutazione esterna ha utilizzato altri reagenti RT-PCR di base (Master Mix in 1 passaggio TaqMan Fast Virus) e ripetuto lo studio di sensibilità, con risultati equivalenti (gene E: 3.2 Copie / reazione di RNA (IC al 95%: 2,2–6,8); RdRP: 3.7 Copie / reazione di RNA (IC al 95%: 2,8–8,0). Da notare, il N Anche il saggio genico ha funzionato bene ma non è stato sottoposto a un’ulteriore convalida intensiva perché leggermente
meno sensibile

Sensibilità basata sull’RNA trascritto in vitro identico al romanzo target del coronavirus del 2019 sequenze

Sebbene entrambi i test abbiano rilevato 2019-nCoV senza polimorfismi nei siti di legame agli oligonucleotidi , abbiamo inoltre generato RNA trascritto in vitro standard che corrispondevano esattamente alla sequenza del 2019-nCoV per la quantificazione assoluta e lo studio del limite di rilevamento (LOD). Sono state fatte reazioni replicate a concentrazioni attorno all’end point di rilevazione determinate in esperimenti preliminari di diluizione.

Il LOD risultante dai test replicati era di 3,9 copie per reazione per il saggio del gene E e 3,6 copie per reazione per il Dosaggio RdRp (Figura 3C e D). Queste cifre erano vicine alla percentuale di successo del 95% di 2,9 copie per reazione, secondo alla distribuzione di Poisson, prevista quando un RNA la molecola viene rilevata.

Discriminazione del romanzo coronavirus del 2019 da Coronavirus SARS mediante dosaggio RdRp

Seguendo la logica che può essere SARS-CoV RNA utilizzato come controllo positivo per l’intera procedura di laboratorio, ovviando così alla necessità di gestire 2019-nCoV RNA, abbiamo formulato il dosaggio RdRp in modo che contenga due sonde: una sonda ad ampio raggio che reagisce con SARSCoV e 2019-nCoV e una sonda aggiuntiva che reagisce solo con 2019-nCoV.

Limitando gli esperimenti di diluizione, abbiamo confermato che entrambe le sonde, usate singolarmente o in combinazione, fornivano lo stesso LOD per ogni virus bersaglio. La sonda specifica RdRP_SARSr-P2 rilevato solo la trascrizione dell’RNA 2019-nCoV ma non quella SARS-CoV RNA.

Campo di rilevamento per SARS coronavirus da pipistrelli

Allo stato attuale, la potenziale esposizione a una fonte ambientale comune nei primi casi segnalati implica la possibilità di infezioni zoonotiche indipendenti con maggiore variabilità della sequenza .

Per dimostrare che il i saggi sono in grado di rilevare altri SARS associati alla mazza virus, abbiamo usato il test del gene E per testare sei campioni fecali batderivati disponibili da Drexler et al.und Muth et al. Questi campioni positivi al virus derivava da pipistrelli rinolofidi europei.

Rivelazione di questi valori anomali filogenetici nell’ambito della SARS Il clade CoV suggerisce che è probabile che tutti i virus asiatici lo facciano essere rilevato. Ciò teoricamente garantirebbe ampio sensibilità anche in caso di molteplici acquisizioni indipendenti di virus varianti da un serbatoio di animali.

Esclusività del nuovo coronavirus 2019 basato su clinico campioni pre-testati positivi per altri virus respiratori

Usando i test del gene E e RdRp, abbiamo testato un totale di 297 campioni clinici da pazienti con vie respiratorie malattia dalle biobanche di cinque laboratori che fornire servizi diagnostici (uno in Germania, due in Paesi Bassi, uno a Hong Kong, uno nel Regno Unito). Noi selezionato 198 campioni da tre università mediche centri in cui i pazienti di terapia generale e intensiva reparti e reparti ambulatoriali principalmente pediatrici (Germania, Paesi Bassi, Hong Kong).

I rimanenti campioni sono stati forniti da servizi sanitari pubblici nazionali che effettuano la sorveglianza studi (RIVM, PHE), con campioni principalmente presentati dai praticanti. I campioni contenevano il più ampio gamma di agenti respiratori possibili e riflessi spettro generale delle concentrazioni di virus riscontrate nei laboratori diagnostici di questi paesi.

In totale, questo test non ha prodotto esiti falsi positivi. In quattro singole reazioni al test, debole reattività iniziale è stato visto ma erano negativi al momento del test lo stesso test. Questi segnali non erano associati
con qualsiasi virus particolare e per ogni virus con cui si è verificata una reattività positiva iniziale, ce n’erano altre campioni che contenevano lo stesso virus a una concentrazione più elevata ma non risultavano positivi.

Dati i risultati dalla vasta qualifica tecnica descritta sopra, si è concluso che questa reattività iniziale era non a causa dell’instabilità chimica delle sonde PCR in tempo reale ma molto probabilmente per gestire i problemi causati dal rapida introduzione di nuovi test e controlli diagnostici durante questo studio di valutazione.

Cosa possiamo pensarci?

La presente relazione descrive l’istituzione di a flusso di lavoro diagnostico per il rilevamento di un virus emergente in assenza di fonti fisiche di genomica virale acido nucleico. Il progetto di analisi efficace è stato abilitato da volontà degli scienziati cinesi di condividere il genoma
informazioni prima della pubblicazione formale, nonché il disponibilità di ampie conoscenze di sequenza a partire da circa 15 anni di indagine sui virus correlati alla SARS negli animali serbatoi.

La relativa facilità con cui i test potrebbero essere progettato per questo virus, a differenza di SARS-CoV in 2003, dimostra l’enorme valore collettivo del descrittivo studi sull’ecologia delle malattie e sulla diversità del genoma virale La RT-PCR in tempo reale è ampiamente utilizzata nella virologia diagnostica.

Nel caso di un’emergenza di sanità pubblica, i laboratori diagnostici competenti possono fare affidamento su questa solida tecnologia per stabilire nuovi test diagnostici all’interno i loro servizi di routine prima dei test pre-formulati diventa disponibile. Oltre alle informazioni su reagenti, oligonucleotidi e controlli positivi, i laboratori lavorano nell’ambito di programmi di controllo di qualità è necessario fare affidamento sulla documentazione relativa alla qualificazione tecnica della formulazione del dosaggio nonché sui dati provenienti da test di valutazione clinica esterni.

La fornitura di modelli di controllo RNA è stata implementata in modo efficace dal progetto EVAg che fornisce reagenti correlati ai virus provenienti da raccolte di ricerca accademiche. L’RNA di SARSCoV era recuperabile da EVAg prima del presente focolaio; prodotti specifici come trascrizioni di RNA poiché i saggi qui descritti sono stati inizialmente recuperabili dal catalogo online EVAg del 14 gennaio 2020.

Tecnico dati di qualificazione basati su materiali di coltura cellulare e
costrutti sintetici, nonché i risultati dei test di esclusività su 75 campioni clinici, sono stati inclusi nella prima versione del protocollo diagnostico fornito al OMS il 13 gennaio 2020.

Basati su un’efficiente collaborazione in una rete informale di laboratori, questi i dati sono stati aumentati entro 1 settimana comprendono test risultati basati su una vasta gamma di agenti patogeni respiratori in campioni clinici da infezioni naturali. paragonabile studi di valutazione durante la qualificazione normativa di i test diagnostici in vitro possono richiedere mesi per l’organizzazione, l’implementazione legale e la logistica e in genere dopo che il picco di un focolaio è calato.

Il velocità ed efficacia del presente schieramento e gli sforzi di valutazione sono stati attivati ​​da National e Reti di ricerca europee istituite in risposta alle crisi sanitarie internazionali degli ultimi anni, a dimostrazione dell’enorme capacità di risposta che può essere rilasciato attraverso un’azione coordinata di accademici e laboratori pubblici. Questa capacità di laboratorio no supporta solo interventi immediati di sanità pubblica ma consente ai siti di arruolare pazienti durante la rapida clinica risposte di ricerca.