Metodo rapido, sensibile e specifico per rilevare il virus nano del riso mediante ibridazione Northern blot

  1. Basato sulla stabilità dell’RNA a doppio filamento (ds), è stato sviluppato un metodo nuovo, veloce, sensibile e specifico per rilevare il dsRNA del virus genomico nano del riso (RDV) mediante ibridazione molecolare.
  2. Contrariamente all’analisi Northern blot standard comunemente usata, il dsRNA viene denaturato sulla macchia nello stato immobilizzato. Pertanto,  il rischio di degradazione dell’RNA a filamento singolo (ss) da parte della ribonucleasi (RNasi) durante la preparazione del campione, l’elettroforesi e il blotting viene eliminato.
Questo metodo supera lo svantaggio della denaturazione incompleta del dsRNA nell’analisi Northern blot. Nel complesso, il metodo appena sviluppato è affidabile, sensibile, molto specifico e di basso livello. L’intera procedura richiede anche meno tempo; può essere fatto in 2-3 giorni. Il nuovo metodo può essere considerato una modifica dell’analisi standard del Northern blot.

Applicazione del test di screening Falcon – test di immunoassorbimento enzimatico (  FAST  -ELISA) e   blot di immunoelettrotransfer enzimatico   (EITB) per determinare l’incidenza della fasciolisi nell’uomo nell’altopiano boliviano

  • Uno studio congiunto della School of Medicine dell’Università di Porto Rico, del Center for Disease Control, del Ministero della Salute boliviano e di organizzazioni di volontariato private (Foster Parents Plan International e Danchurchaid) che operano in Bolivia ha identificato una regione nel nord-ovest dell’Altiplano boliviano vicino a Il lago Titicaca come l’habitat di maggior prevalenza di fascioliasi nelle popolazioni del mondo. Per determinarne la frequenza sono state utilizzate due tecniche sierologiche (test di immunoassorbimento enzimatico Falcon test [FAST-ELISA] e immunoelettrotransfer blot legato a enzimi [EITB]).
  • Cento campioni di siero e 73 campioni di feci sono stati ottenuti dagli indiani Aymara di Corapata, in Bolivia. I livelli di assorbimento dell’anticorpo per gli antigeni di eliminazione della secrezione di Fasciola hepatica sono stati confrontati con i  modelli di bande EITB utilizzando la stessa preparazione dell’antigene. Un FAST-ELISA positivo è stato definito come il valore di assorbanza maggiore  della media più tre deviazioni standard dei due gruppi di controlli negativi normali (portoricano e boliviano).
  • Utilizzando questo criterio, 53 su 100 sieri testati sono risultati positivi con questa tecnica. In questo gruppo, 19 (95%) delle 20 persone che avevano parassiti sono risultate positive anche al test FAST-ELISA. Anche altri 24 soggetti che non hanno ricevuto uova di F. hepatica e 10 che non hanno ricevuto alcun campione sono risultati positivi al test FAST-ELISA. Delle 53 uova di F. hepatica negative, 29 erano anche FAST-ELISA negative. L’analisi EITB dei sieri di individui infetti confermati ha rivelato almeno tre bande di F. hepatica (Fh) con pesi molecolari rispettivamente di 12, 17 e 63 kD. (ASTRATTO DISEGNATO A 250 PAROLE).

IMMUNODIAGNOSTICA DELLA DRACUNCULISI MEDIANTE IL TEST FALCON-SAGGIO IMMUNOSORBENTE LEGATO A ENZIMI (  FAST  -ELISA) E LA TECNICA DI IMMUNO ELETTROTRASFERIMENTO ENZYMATICO (EITB)  .

  1. Lo screening dell’immunosorbente legato all’enzima del test Falcon (FAST-ELISA) e la tecnica enzimatica immunoelectrotransfer blot (EITB) sono stati utilizzati per testare sieri umani con l’antigene Dracunculus medinensis adulto per valutarne il potenziale valore nell’immunodiagnosi della dacuncolosi. I sieri umani utilizzati sono stati ottenuti da pazienti con infezione da D. medinensis pre-brevetto e brevettata o da pazienti infetti da altri nematodi (Onchocerca volvulus e Loa loa) o trematodi (Schistosoma mansoni e S. haematobium) nonché da nigeriani normali non infetti e Controlli portoricani. Nel test FAST-ELISA, i sieri di pazienti con dracunculiasi in prepatenza e brevetto hanno fornito i valori di assorbimento più elevati rispetto ai normali sieri umani.
  2. La maggiore reattività crociata è stata osservata con sieri da oncocercosi; Nessuna reattività crociata è stata osservata con i sieri di individui con schistosomiasi o ematobia loase o mansoni. Secondo l’EITB, i sieri di pazienti con draculosi hanno riconosciuto specificamente la proteina 16 kDa (Dm 16) e gli anticorpi anti-Dm 16 sono scomparsi 2 mesi dopo l’estrazione del verme. Dm 16 è stato diagnosticato dalla fase pre-patente tardiva. La proteina 17 kDa (Dm 17) è stata riconosciuta anche dai sieri di dracunculiasi, ma gli anticorpi anti-Dm 17 sono scomparsi più lentamente ed erano presenti 1 anno dopo il recupero. Gli antigeni D. medinensis da 16 kDa e 17 kDa possono essere utili nell’immunodiagnosi della dracuncolosi.

Quantificazione delle proteine ​​su gel e blot mediante fluorescenza infrarossa Coomassie Blue e Fast Green.

  1. La colorazione blu di Coomassie di gel e blot è ampiamente utilizzata per il rilevamento e la quantificazione delle proteine ​​mediante densitometria. Abbiamo scoperto che Coomassie Blue o Fast Green FCF si legano alle proteine ​​fluorescenti del vicino infrarosso. Abbiamo utilizzato questa proprietà per  sviluppare un metodo rapido e sensibile per rilevare e quantificare le proteine ​​in gel e blot  .
  2. La risposta di fluorescenza è quantificata per un contenuto proteico da 10 ng a 20 microg per banda o spot. La colorazione e la decolorazione richiedono solo 30 minuti e il metodo è compatibile con la successiva immunorilevazione.

Tecnica modificata di western  blot per il  rilevamento rapido   dell’eme ossigenasi (HO-1 / HO-2) in vari tessuti e organi di animali da esperimento

  • Lo scopo di questo studio era definire tutte le condizioni necessarie per la rilevazione dell’eme ossigenasi (HO) mediante la tecnica del western blot. Il nostro metodo di immunoblotting modificato ha consentito di rilevare HO dopo 2 ore di elettrotrasferimento su membrane di nitrocellulosa, che evidentemente ha ridotto  i tempi di test senza perdere la sensibilità e la specificità nel rilevare HO in vari tessuti e organi di animali da esperimento.
  • HO è stato rilevato nel cervello, cuore, rene, fegato, polmone, milza, testicoli e timo del topo e del ratto testati in una quantità che fornisce la prova che questa tecnica di immunoblotting modificata è sufficientemente sensibile da indurre l’esistenza di questo enzima in vari tessuti e organi degli animali. In conclusione, il nostro metodo Western blot modificato consente il rilevamento rapido di HO, che può essere utile per ulteriori ricerche quantitative più avanzate.

Rapid    Western   blot  migliorato per la quantificazione mediante etichettatura a fluorescenza diretta degli anticorpi primari

  1. Le procedure Western blot esistono da molto tempo e i recenti progressi hanno aumentato la sensibilità delle tecniche di luminescenza in modo tale che la necessità di sonde radioattive è stata limitata a poche applicazioni. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli richiede più di 6 ore e spesso richiede più di un giorno. La maggior parte delle tecniche richiede un anticorpo secondario coniugato a un enzima che catalizza una reazione cromatica per migliorare un segnale rilevabile. Tuttavia, entrambi i processi, il legame dell’anticorpo secondario e la reazione catalizzata con il colorante, sono  fonti di errore, quest’ultima essendo svantaggiosa per un segnale che è lineare nell’intervallo più ampio dell’antigene rilevato.
  2. Al fine di migliorare la procedura più comunemente utilizzata per quantificazione e convenienza, abbiamo studiato l’uso dell’etichettatura fluorescente di anticorpi monoclonali primari contro le subunità della RNA polimerasi di Escherichia coli (beta ‘, sigmaE e sigmaFecI) e il loro uso nell’analisi Western blot. Abbiamo ottenuto una sensibilità (<1 ng di proteina rilevabile) paragonabile alla maggior parte delle tecniche luminescenti.

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNCAP0371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC810371-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC810371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC880371-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC880371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNCB0371-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNCB0371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC550371-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC550371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC430371-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC430371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC470371-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC470371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC940371-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC940371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNCP0371-250 Biotium 250uL 383 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC040371-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC040371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC050371-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC050371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNCR0371-250 Biotium 250uL 383 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNUB0371-100 Biotium 100uL 209 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNUB0371-500 Biotium 500uL 458 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC680371-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC680371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC700371-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC700371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC800371-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC800371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC400371-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC400371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC610371-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNC610371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNCH0371-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNCH0371-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin pan(AE-1 / AE-3) Antibody

BNUM0371-50 Biotium 50uL 395 EUR

Monoclonal Cytokeratin, pan (Epithelial Marker) Mouse Monoclonal Antibody [Clone AE-1/AE-3], Clone: AE-1/AE-3

APR15662G Leading Biology 0.1 ml 484 EUR

AE-6530MW mPAGE

2321915 Atto 1unit 554 EUR

AE-1410 EzRun

2332310 Atto 5unit 272 EUR

AE-1412 EzRunC+

2332320 Atto 2unit 272 EUR

AE-1415 EzRunT

2332325 Atto 3unit 311 EUR

AE-1430 EzApply

2332330 Atto 3unit 246 EUR

AE-1435 EzApply2Dkit

2332335 Atto 2unit 387 EUR

AE-1440 EzStandard

2332340 Atto 3unit 311 EUR

AE-1460 EzBlot

2332600 Atto 2unit 272 EUR

AE-1490 EzWestBlue

2332630 Atto 2unit 272 EUR

Rat Kidney Whole tissue lysate

RAL-1465 Alpha Diagnostics 1 mg 524 EUR

Angiotensin

RP-1465 Alpha Diagnostics 1 mg 286 EUR

ZW10 antibody

10R-1465 Fitzgerald 100 ug 512 EUR

ASK1 antibody

20R-1465 Fitzgerald 100 ug 673 EUR

AURKA Blocking Peptide

33R-1465 Fitzgerald 100 ug 180 EUR

Cholesterol Quantitation Kit

55R-1465 Fitzgerald 100 assays 723 EUR

proBNP antibody (biotin)

60R-1465 Fitzgerald 100 ug 327 EUR

CD10 antibody (biotin)

61R-1465 Fitzgerald 100 ug 284 EUR

PCBP2 antibody

70R-1465 Fitzgerald 100 ug 377 EUR

IAA-BSA

80-1465 Fitzgerald 1 mg 349 EUR

ECHS1 protein (His tag)

80R-1465 Fitzgerald 100 ug 305 EUR

Cytokeratin, Pan (Epithelial Marker); Clone AE-1 & AE-3 (Concentrate)

RA0382-C.1 ScyTek Laboratories 0.1 ml 125 EUR

Cytokeratin, Pan (Epithelial Marker); Clone AE-1 & AE-3 (Concentrate)

RA0382-C.5 ScyTek Laboratories 0.5 ml 300 EUR

Anti-Cytokeratin Antibody Clone AE-1/AE-3, Unconjugated-100ug

MSM2-371-P1 EnQuireBio 100ug 428 EUR

AE-6530M mPAGE Chamber

2321900 Atto 1unit 429 EUR

AE-6530P mPAGE Chamber

2321905 Atto 1unit 429 EUR

Dummy plate, AE-6220

2328796 Atto 3unit 276 EUR

AE-7065 EzRun MOPS

2332326 Atto 3unit 261 EUR

AE-1440-2 EzStandard

2332345 Atto 2unit 373 EUR

AE-1450 EzStandard prestainBlue

2332347 Atto 2unit 301 EUR

AE-1310 EzStain reverse

2332350 Atto 2unit 330 EUR

AE-1360 EzStain silver

2332360 Atto 2unit 330 EUR

AE-1340 EzStain Aqua

2332370 Atto 3unit 311 EUR

AE-1390 SDS-eliminant

2332390 Atto 2unit 301 EUR

AE-1475 EzBlock Chemi

2332615 Atto 3unit 294 EUR

AE-1476 EzBlock BSA

2332616 Atto 3unit 294 EUR

AE-1477 EzBlock CAS

2332617 Atto 3unit 294 EUR

Spring Set , AE-6220

2392051 Atto 5unit 259 EUR

AE-6935B Visirays-B

2008001 Atto 1unit 2384 EUR

AE-6935GS Visirays-GS

2008011 Atto 1unit 2384 EUR

AE-6935GL Visirays-GL

2008012 Atto 1unit 2384 EUR

Monoclonal Cytokeratin, pan (Epithelial Marker) Antibody, Clone: AE-1/AE-3

APR14634G Leading Biology 0.1 ml at 0.1mg/ ml 484 EUR

Monoclonal Cytokeratin, pan (Epithelial Marker) Antibody, Clone: AE-1/AE-3

APR14635G Leading Biology 7 ml 484 EUR

AE-6111 Agarose EP Kit

2322178 Atto 1unit 863 EUR

AE-6200 Slab EP Chamber

2392985 Atto 1unit 981 EUR

Gel carrier for AE-6541

2394140 Atto 10unit 253 EUR

Histone H1(AE-4) Antibody

BNCA0096-250 Biotium 250uL 383 EUR

Cytokeratin LMW(AE-1) Antibody

BNCA0253-250 Biotium 250uL 383 EUR

Cytokeratin HMW(AE-3) Antibody

BNCA0257-250 Biotium 250uL 383 EUR

Nuclear Membrane(AE-5) Antibody

BNCA0867-250 Biotium 250uL 383 EUR

Golgi Complex(AE-6) Antibody

BNCA0868-250 Biotium 250uL 383 EUR

Mitochondrial Marker(AE-1) Antibody

BNCA0905-250 Biotium 250uL 383 EUR

UACA / Nucling(AE-5) Antibody

BNCA0956-250 Biotium 250uL 383 EUR

Histone H1(AE-4) Antibody

BNCAP0096-100 Biotium 100uL 199 EUR

Histone H1(AE-4) Antibody

BNCAP0096-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin LMW(AE-1) Antibody

BNCAP0253-100 Biotium 100uL 199 EUR

Cytokeratin LMW(AE-1) Antibody

BNCAP0253-500 Biotium 500uL 544 EUR

Cytokeratin HMW(AE-3) Antibody

BNCAP0257-100 Biotium 100uL 199 EUR

Inoltre, abbiamo ridotto significativamente il tempo di trattamento a meno di 1 ora dopo SDS-PAGE e lo abbiamo trasferito sulla membrana. Innanzitutto, abbiamo ottenuto un segnale lineare che varia da 30 ng a 1 microg di proteine ​​(a seconda delle dimensioni della proteina), rendendo la quantificazione del Western blot più semplice e affidabile.